药物申报CAR-T夹心ELISA实验操作步骤

heshao · 发表于 2022-12-06 17:10:47

　　双抗体夹心法，其基本原理是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入含有抗原之待测样品，药物申报CAR-T通过加入酶标记特异性抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。该方法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
　　一、实验步骤
　　1.用捕获抗体包被
　　①以捕获抗体浓度为1-10μg/mL的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）包被PVC微量滴定板的孔。
　　②未纯化抗体（例如腹水液或抗血清）可能需要增加样品蛋白质的浓度（尝试用10μg/mL）补偿浓度更低的特异性抗体。
　　③用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜。
　　④弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
　　2.封闭和加样
　　①每孔添加 200μL 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/PBS）封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
　　②用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少1-2小时，或在4℃下孵育过夜。
　　③用200 μL PBS洗涤微量滴定板两次。
　　④将100 μL 稀释样品添加到每个孔。通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样品。37°C条件下孵育90分钟。确保标准品浓度涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能需要优化浓度范围以获得合适的标准曲线。通常样品和标准品采取两重测定或三重测定。
　　⑤移除样品，用200μL PBS洗涤微量滴定板两次。
　　3.用检测抗体和二抗孵育
　　①将100μL稀释的检测抗体添加到每个孔。确保检测抗体识别与捕获抗体靶蛋白的不同表位。这可防止对抗体结合的干扰。尽可能使用已测试的成对匹配抗体。
　　②用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育2小时。
　　③用PBS洗涤微量滴定板四次。
　　④添加100μL偶联二抗，使用将其在封闭缓冲液中稀释。
　　⑤用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育1-2小时。
　　⑥用PBS洗涤微量滴定板四次。

huyi1009 · 发表于 2025-12-03 03:39:23

完全赞同，我也是这么认为的，英雄所见略同～

西万路小混混 · 发表于 2026-04-17 06:59:27

楼主太厉害了，整理得这么详细，必须支持

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